Detección de trazas de soja y de leche en productos libres de gluten: desarrollo de dos enzimoinmunoensayos competitivos / Detection of traces of soy and milk in gluten-free products: development of two competitive enzyme immunoassays / Detecção de vestígios de soja e leite em produtos livres de glúten: desenvolvimento de dois enzimoimunoensaios competitivos

Resumen El objetivo del presente trabajo fue el desarrollo de dos enzimoinmunoensayos competitivos (EIC) para la detección de trazas de soja y de leche en productos libres de gluten. Como anticuerpos primarios se utilizaron antisueros policlonales de conejo específicos contra proteínas de soja o de leche. Se determinaron las concentraciones óptimas de antígenos a inmovilizar en la placa y las concentraciones de anticuerpos primarios a utilizar en la competencia. Las curvas de calibración se ajustaron utilizando concentraciones crecientes de un extracto de producto de soja y de un extracto de leche descremada en polvo. El producto de soja y la leche descremada se extrajeron con buffer Tris-HCl 0,0625 M con dodecilsulfato de sodio al 3% y sulfito de sodio 0,1 M al 2%. Se evaluaron los parámetros de validación: linealidad, límites de detección y de cuantificación, recuperación y precisión en el día y entre días, los cuales resultaron adecuados. Se analizaron 9 productos libres de gluten con los EIC desarrollados y con kits de ELISA comerciales. Ambos EIC se comportaron de manera similar con respecto a los kits comerciales. Los EIC permitieron confirmar la presencia de leche en las muestras que la declaraban. En algunas muestras que no declaraban ni leche ni soja, ambos EIC detectaron su presencia (resultados confirmados con los kits comerciales). Los EIC desarrollados poseen menor costo que los kits y, por lo tanto, éstos podrían utilizarse como métodos de screening. Cuando esta metodología resulte negativa, debe confirmarse con un método más sensible (comercial) para garantizar la ausencia de proteínas de soja o de leche.

Abstract The aim of this study was to develop two competitive enzyme immunoassays (CEI) to detect the presence of traces of soy and milk in gluten-free products. Specific rabbit polyclonal antiserums against soy protein and other against elemilk protein were used as primary antibodies. Optimal antigen concentrations to be immobilized on the plate and primary antibody concentrations to be used in competition were determined. The calibration curves were fitted using increasing concentrations of an extract of soy product and of defatted milk powder. The soy product and the defatted milk were extracted with Tris-HCl buffer 0,0625 M with 3% sodium dodecyl sulfate and 2% sodium sulfite 0.1 M. The validation parameters were evaluated: linearity, limit of detection and quantification, recovery and precision on the day and in between days. They were appropriate. Nine commercial samples of gluten-free products were analyzed with these developed CEI and commercial ELISA kits. It was observed that both CEI behaved similarly with respect to the commercial kits. The enzyme immunoassays confirmed the presence of milk in samples that declared it. In some samples that did not declare the presence of milk or soy, both enzyme immunoassays detected their presence -these results were confirmed using commercial kits. The developed CEI have a lower cost than the commercial kits, so these could be used as screening methods. When this methodology is negative, it should be confirmed with a more sensitive (commercial) method to ensure the absence of soy or milk protein.

Resumo O objetivo do presente trabalho foi o desenvolvimento de dois enzimoimunoensaios competitivos (EIC), para a detecção de vestígios de soja e leite em produtos livres de glúten. Antissoros policlonais de coelho específicos contra proteínas de soja ou de leite foram utilizados como anticorpos primários. Foram determinadas as concentrações ótimas de antígenos a serem imobilizados na placa e as concentrações de anticorpos primários a serem utilizadas na competição. As curvas de calibração foram ajustadas usando concentrações crescentes de um extrato de produto de soja e de um extrato de leite em pó desnatado. O produto de soja e o leite desnatado foram extraídos com tampão Tris-HCl 0,0625 M com dodecil sulfato de sódio a 3% e sulfito de sódio 0,1 M a 2%. Os parâmetros de validação foram avaliados: linearidade, limite de detecção e quantificação, recuperação e precisão no dia e entre os dias, os quais resultaram adequados. Nove produtos livres de glúten foram analisados com os EIC desenvolvidos e com kits de ELISA comerciais. Os dois EICs se comportaram de maneira semelhante em relação aos kits comerciais. Os EIC permitiram confirmar a presença de leite nas amostras que o declararam. Em algumas amostras que declaravam nem leite nem soja, ambos os EIC detectaram sua presença (resultados confirmados usando kits comerciais). Os EIC desenvolvidos têm um custo menor que os kits, portanto, eles poderiam ser utilizados como métodos de triagem. Quando esta metodologia é negativa, deve ser confirmada com um método mais sensível (comercial) para garantir a ausência de proteínasda soja ou do leite.

Métodos electroforético e inmunoquímicos para detectar proteínas de leche, soja y huevo en premezclas comerciales / Electrophoretic and immunochemical methods for the detection of milk, soy and egg proteins in commercial mix products

The presence of milk, egg and soy proteins was evaluated in thirteen commercial products, which were premixes to make cream caramel, cake, soy "milanesas", "tortas fritas", pizza, gnocchi and complementary foods. Samples were analysed using SDS-PAGE, immunoblotting and ELISA methods. The electrophoretic method and immunoblotting were useful to confirm the presence of milk, egg and soy proteins in four samples that declared them as ingredients. In other samples, both methods showed negative results for some of these proteins, although they were also declared as ingredients. This suggests that those proteins were not added as ingredients in these products. The ELISA kits detected very low concentration of the allergenic proteins in four products with precautionary phrases and also in five samples that made no reference to them in their labels. ELISA methods are useful to detect cross contamination due to their high sensitivity. The food industry should be responsible for the declaration of milk, egg and soy proteins in their food labels.

Se evaluó la detección de proteínas de leche, huevo y soja en trece productos comerciales, correspondientes a premezclas para preparar flanes, bizcochuelo, milanesas de soja, tortas fritas, pizza, ñoquis y productos en polvo a base de harinas para niños pequeños. Las muestras fueron analizadas por SDS-PAGE, inmunoblotting y métodos de ELISA. El método electroforético e inmunoblotting resultaron útiles para confirmar la presencia de las proteínas alergénicas en algunas muestras que las declaraban como ingredientes. En cuatro muestras que también declaraban como ingredientes alguna de estas proteínas, tanto con SDS-PAGE como con Inmunoblotting, los resultados fueron negativos, sugiriendo que dichas proteínas no fueron agregadas como ingredientes en dichos alimentos. Los kits de ELISA permitieron la detección de concentraciones muy bajas de estos alérgenos en cuatro productos que presentaban frases de advertencia e incluso en otros cinco que no tenían ninguna declaración de alérgenos. Los métodos de ELISA son útiles para detectar contaminaciones cruzadas, dada su elevada sensibilidad. Se concluye que resulta necesario una declaración responsable de estas proteínas alergénicas, en los rótulos de este tipo de alimentos por parte de los fabricantes.

Detección de proteínas lácteas en alimentos infantiles en polvo con frases de advertencia / Detection of Milk Proteins in Powder Infant Foods with Precautionary Statements / Detecção de proteínas lácteas em alimentos infantis em pó com frases de advertência

En Argentina, la Comisión Nacional de Alimentos debe elaborar una propuesta de adecuación de la Declaración obligatoria de los componentes alérgenos en el rótulo de los alimentos (art. 235 séptimo del Código Alimentario Argentino). La posibilidad de declarar frases de advertencia es uno de los temas en estudio. En el mercado se encuentran productos en polvo para lactantes y niños en la primera infancia que presentan la frase: Elaborado enuna línea donde se procesan productos con leche. El objetivo del presente trabajo fue analizar este grupo de alimentos con el fin de determinar la posible presencia de proteínas lácteas. Las muestras analizadas fueron cuatro lotes diferentes de los productos 5 cereales, Arroz, Trigo con miel, Vainilla, Maíz y Trigo con frutas. La determinación de leche se realizó utilizando kits ELISA de las marcas r-biopharm y Veratox de Neogen. Debido a que no existe un consenso internacional respecto de los valores umbrales para la posible declaración de alérgenos en alimentos, se consideraron como valores de referencia los de la legislación japonesa; el programa EU- VITAL y el programa VITAL 2.0. De acuerdo con los resultados obtenidos, 15 lotes presentaron valores de leche por debajo delos límites de cuantificación de los kits y 9 lotes presentaron concentraciones desde 2,9 hasta 17,5 ppm de proteínas de leche. Considerando los valores obtenidos para cada lote se estableció, para cada legislación o programa internacional, de qué manera debería declarar se el alérgeno leche. De acuerdo con nuestros resultados, si la empresa lleva a cabo un plan eficaz de control de alérgenos en los productos analizados, nos parece que sería adecuado el uso de una frase de advertencia.

In Argentina, the National Food Commission (CONAL, byits acronym in Spanish) should formulate a modification of the mandatory declaration of allergens on food labels (art. 235 7° of the Argentine Food Code). The possibility of using allergen precautionary statements is one of the items under study. In the market there are powder products for infants and children in early childhood that show the phrase "produced in a factory that processes milk products". The aim of this study was to analyse this group of foods in order to determine the possible presence of milk proteins. Samples from four different batches of the products 5 cereals, rice, wheat with honey, vanilla, corn and wheat with fruit were analysed. The detection and quantification of milk was performed using ELISA kits from R- biopharm and Veratox from Neogen. As there is no international consensus on threshold values for the possible declaration of allergens in foods, the Japanese legislation, the EU VITAL program and the VITAL 2.0 program were considered as reference values. According to the results obtained, the milk values were below the detection limits of the kits in 15 batches and the concentration of milk proteins were between 2,9 and 17,5 ppm in 9 batches. With the values obtained for each batch, it was established how the milk allergen has to be declared according to the legislation or international program considered as reference value. In view of our results, if the company carries out an effective plan to control allergens, the use of a allergen precautionary statement in the tested products seems to be appropriate.

Na Argentina, a Comissão Nacional de Alimentos deve elaborar uma proposta de adequação da Declaração obrigatória dos componentes alérgenos no rótulo dos alimentos ((art. 235 sétimo do Código Alimentar Argentino). A possibilidade de declarar frases de advertência é um dos sistemas em estudo. No mercado existem produtos em pó para lactantes e crianças na primeira infância que apresentam a frase: Elaborado em um alinha onde são processados produtos com leite. O objetivo do presente trabalho foi analisar este grupo de alimentos com o fim de determinar a possível presença de proteínas lácteas. As amostras analisadas foram quatro lotes diferentes dos produtos 5 cereais, Arroz, Trigo com mel, Baunilha Milho e Trigo com frutas. A determinação de leite foi realizada utilizando ELISA das marcas r-biopharm e Veratox da Neogen. Devido ao fato de que não existe um consenso internacional a respeito dos valores limiares para a possível declaração de alérgenos em alimentos, foram considerados como valores de referência os da legislação japonesa; o programa EU- VITAL e o programa VITAL 2.0. De acordo com os resultados obtidos, 15 lotes apresentaram valores de leite abaixo dos limites de quantificação dos kits e 9lotes apresentaram concentrações de 2,9 até 17,5 ppm de proteínas de leite. Considerando os valores obtidos para cada lote foi estabelecido, para cada legislação ou programa internacional, de que modo deveria ser declarado o alérgeno leite. De acordo com os nossos estudos, se a empresa realiza um plano eficaz de controle de alérgenos nos produtos analisados, acreditamos que seria adequado o uso de uma frase de advertência.

Comparación de SDS-PAGE y métodos inmunoquímicos para la detección de proteínas de soja en productos cárnicos crudos y cocidos / Comparison of SDS-PAGE and immunochemical methods for the detection of soy proteins in raw and cooked meat products

The aim of this study was to evaluate the detection of soy proteins in raw and cooked meat products using SDS-PAGE and immunochemical methods. Ten raw model systems of bovine meat added with soy protein isolates, eight cooked model systems of boneless ham added with soy protein isolates and eight commercial meat products were analized. Model systems and commercial samples were analyzed by SDS-PAGE, Dot Blot, Immunoblotting and ELISA (Soy allergen kit from Neogen). Dot blot and Immunoblotting resulted to be the most sensitive analytical methods for the detection of soy proteins. The concentrations of the soy protein isolate obtained with the ELISA kit were much lower than real values. Soy proteins that were not declared in the label of several samples were detected using different methods. The heat treatment applied to the cooked meat products would affect the solubility of soy proteins and their ability to react with the antibodies of the ELISA kit used.

Se evaluó la detección de proteínas de soja en productos cárnicos crudos y cocidos utilizando SDS-PAGE y métodos inmunoquímicos. Se analizaron diez sistemas modelo de mezclas de carne vacuna con agregado de aislado de soja, ocho sistemas modelo de fiambres de cerdo con agregado de aislado de soja y ocho muestras comerciales. Los sistemas modelo y las muestras fueron analizadas por SDS-PAGE, Dot blot, Inmunoblotting y ELISA soja de Neogen. Dot Blot e Inmunoblotting resultaron los métodos más sensibles para la detección de proteínas de soja. Con el método de ELISA se obtuvieron valores de concentraciones de aislado de soja muy inferiores a los valores reales. En varias muestras comerciales se detectaron con los distintos métodos proteínas de soja no declaradas en los respectivos rótulos. El tratamiento térmico aplicado en los productos cocidos afectaría la solubilidad de las proteínas de soja y su capacidad para reaccionar con los anticuerpos presentes en el kit de ELISA utilizado.

Salazones y chacinados embutidos secos: detección por electroforesis de especies cárnicas y de proteínas extrínsecas agregadas / Dry-cured meat products: electrophoresis detection of meat species and extrinsic proteins added

En la elaboración de salazones y chacinados embutidos secos se pueden utilizar diferentes especies cárnicas y en algunos de ellos también se pueden agregar proteínas extrínsecas. En elpresente trabajo se plantearon los siguientes objetivos: analizar salazones y chacinados embutidos secos elaborados con especies cárnicas de diferente origen (vacuna, porcina, de ciervo, de jabalí y de cordero) para establecer la utilidad de SDS-PAGE en la identificación de las mismas; comparar esta metodología conun método inmunoquímico (ELISA para especie porcina y ELISA para especie vacuna) en muestras que declaraban carne porcina y/o vacuna; detectar la posible presencia de proteínas extrínsecasdeclaradas o no en los respectivos rótulos de estos productos. Se analizaron 5 salazones y 7 chacinados embutidos secos. En todas las muestras se detectaron por electroforesis la o lasespecies cárnicas declaradas, sólo en una muestra que declaraba carnes vacuna y porcina se detectó sólo carne vacuna. Lametodología inmunoquímica confirmó la detección de las carnes vacuna y/o porcina en las muestras que las declaraban. Con respecto a las proteínas extrínsecas se detectaron por electroforesis proteínas de soja en tres muestras, dos de ellas no las declaraban.Se detectaron proteínas lácteas en muy baja concentración en tres muestras que las declaraban y se detectaron proteínas de trigo en dos muestras que no las declaraban. Las tres proteínas detectadas en estas muestras constituyen alergenos alimentarios. Si bien el método ELISA resulta de elección para la detecciónde alergenos alimentarios, ya que tiene una sensibilidad mucho mayor al SDS-PAGE, estas proteínas alergénicas fueron detectadas con facilidad por electroforesis, lo cual indica que estaban agregadas en concentraciones importantes. Resulta entonces imprescindible que los elaboradores de este tipo de productos declaren la totalidad de los ingredientes proteicos utilizados para evitar reacciones alérgicas...

Different meat species can be used in dry-cured meat products, and extrinsic proteins can also be added in some of them. The objectives of this work are to analyze dry-cured meat productselaborated with different meat species (cow, swine, deer, boar and lamb) in order to evaluate the usefulness of the SDS-PAGE method in the identification of the species used; to compare thismethodology with an immunochemical method (ELISA for porcine and bovine species respectively) in samples that declare porcine and/or bovine meat in their label; and to detect the possiblepresence of extrinsic proteins declared or not in these products’ labels. Twelve dry-cured meat products were analyzed. In allsamples, the meat species declared in the labels were found by electrophoresis, except in one case where only bovine meat was detected while the label declared both bovine and porcine meats. The immunochemical method confirmed the detection of bovine and/or porcine meat in the samples that declared them in their labels. As regards extrinsic proteins, soy proteins were detected by electrophoresis in three samples, while two of them did not declare these proteins. Dairy proteins were detected in very low levels in three samples that declared them and wheat proteins were detected in two samples that did notdeclare them. The three proteins detected in these samples are food allergens. Although the method of choice for the detection of allergens in food is ELISA because it is more sensible than SDS-PAGE, these allergenic proteins were easily detected by electrophoresis; this indicates they were added in relevant concentrations. It is then critical that manufacturers declare all proteiningredients used in this kind of products to prevent allergic reactions in consumers.

Salazones y chacinados embutidos secos: detección por electroforesis de especies cárnicas y de proteínas extrínsecas agregadas / Dry-cured meat products: electrophoresis detection of meat species and extrinsic proteins added

En la elaboración de salazones y chacinados embutidos secos se pueden utilizar diferentes especies cárnicas y en algunos de ellos también se pueden agregar proteínas extrínsecas. En elpresente trabajo se plantearon los siguientes objetivos: analizar salazones y chacinados embutidos secos elaborados con especies cárnicas de diferente origen (vacuna, porcina, de ciervo, de jabalí y de cordero) para establecer la utilidad de SDS-PAGE en la identificación de las mismas; comparar esta metodología conun método inmunoquímico (ELISA para especie porcina y ELISA para especie vacuna) en muestras que declaraban carne porcina y/o vacuna; detectar la posible presencia de proteínas extrínsecasdeclaradas o no en los respectivos rótulos de estos productos. Se analizaron 5 salazones y 7 chacinados embutidos secos. En todas las muestras se detectaron por electroforesis la o lasespecies cárnicas declaradas, sólo en una muestra que declaraba carnes vacuna y porcina se detectó sólo carne vacuna. Lametodología inmunoquímica confirmó la detección de las carnes vacuna y/o porcina en las muestras que las declaraban. Con respecto a las proteínas extrínsecas se detectaron por electroforesis proteínas de soja en tres muestras, dos de ellas no las declaraban.Se detectaron proteínas lácteas en muy baja concentración en tres muestras que las declaraban y se detectaron proteínas de trigo en dos muestras que no las declaraban. Las tres proteínas detectadas en estas muestras constituyen alergenos alimentarios. Si bien el método ELISA resulta de elección para la detecciónde alergenos alimentarios, ya que tiene una sensibilidad mucho mayor al SDS-PAGE, estas proteínas alergénicas fueron detectadas con facilidad por electroforesis, lo cual indica que estaban agregadas en concentraciones importantes. Resulta entonces imprescindible que los elaboradores de este tipo de productos declaren la totalidad de los ingredientes proteicos utilizados para evitar reacciones alérgicas...(AU)

Different meat species can be used in dry-cured meat products, and extrinsic proteins can also be added in some of them. The objectives of this work are to analyze dry-cured meat productselaborated with different meat species (cow, swine, deer, boar and lamb) in order to evaluate the usefulness of the SDS-PAGE method in the identification of the species used; to compare thismethodology with an immunochemical method (ELISA for porcine and bovine species respectively) in samples that declare porcine and/or bovine meat in their label; and to detect the possiblepresence of extrinsic proteins declared or not in these products labels. Twelve dry-cured meat products were analyzed. In allsamples, the meat species declared in the labels were found by electrophoresis, except in one case where only bovine meat was detected while the label declared both bovine and porcine meats. The immunochemical method confirmed the detection of bovine and/or porcine meat in the samples that declared them in their labels. As regards extrinsic proteins, soy proteins were detected by electrophoresis in three samples, while two of them did not declare these proteins. Dairy proteins were detected in very low levels in three samples that declared them and wheat proteins were detected in two samples that did notdeclare them. The three proteins detected in these samples are food allergens. Although the method of choice for the detection of allergens in food is ELISA because it is more sensible than SDS-PAGE, these allergenic proteins were easily detected by electrophoresis; this indicates they were added in relevant concentrations. It is then critical that manufacturers declare all proteiningredients used in this kind of products to prevent allergic reactions in consumers.(AU)